КЛАССИЧЕСКАЯ ЧУМА СВИНЕЙ
Чума свиней(классическая чума свиней, КЧС, Hog Holera,Classikal swine Fever,Svine Fiver (англ.); Schweinepest (нем.); Pestes Porcine (франц.); Peste Porcina(исп.) - это высококонтагиозная инфекционная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, поражением кровеносной и кроветворной систем, крупозным воспалением легких и крупозно-дифтерическим воспалением толстого кишечника.
Первые описания КЧС, согласно Hanson,относятся к 1810 г.в штате Теннеси (США). Позже в 1830 г вспышка зарегистрирована в штате Охио. Во Франции подобное заболевание отмечалось в 1822 г., в Германии - в 1833 г., но другие сообщения подтверждают, что эта болезнь впервые была открыта в Англии в 1862 г. и, соответственно, распространилась на Европейский континент. В Южной Америке и Южной Африка Заболевание появилось в 1899 и 1890 гг. соответственно. В настоящее время встречается повсеместно, за исключением США, Канады, Австралии, Исландии,Ирландии, Новой Зеландии, Норвегии, Швеции. В результате плановых противоэпизоотических мероприятий и, в частности, широкого применения живой вакцины, масштабы её распространения резко сократились. Наблюдаются ограниченные энзоотические вспышки, наносящие, однако, значительный экономический ущерб.
Сведения о возбудителе.Вирусную природу КЧС установили в 1908 г Швейнитц и Дорсе.
Морфология и химический состав
Вирионы - оболочечные частицы диаметром 40-60 нм с нуклеокапсидом диаметром около 29 нм. В структуре ВКЧС обнаружено 3 гликопротеина с мол.м 44, 33 и 55 кД. Геном вируса -Г-нитевая РНК положительной полярности с размером в 12284 тыс. нуклеотидов.Единственная рамка считывания, вероятно, соответствует полипротеину с длиной 3898 аминокислотных остатков (12 kb), 4 структурным белкам (3 гликопротеида-VPI, VP2, VP3 и 1 капсидный белок -СР) и 3-7 неструктурным белкам (р125, р80,gp62, gp53, gp48, gp25 и gp20). Полагают, что VPI и VP2 представляют собой оболочечные белки. Плавучая плотность, в зависимости от градиента материала и клеток, обеспечивающих размножение вируса, составляет 1,12-1,17 г/см 3.Коэффициент седиментации составляет 140-180S.. Геномная РНК вируса может быть использована в качестве исходного материала для получения к ДНК и ее клонирования.
Устойчивость
ВКЧС считается сравнительно малоустойчивым к высоким температурам. Сыворотка крови больных КЧС при 37°С содержит активный вирус в течение 11 дн. Полная его инактивация при такой температуре наступает через 18-20 сут. При 56°С вирус инактивируется через 60 мин, при кипячении -моментально. В свинарниках (полы, стены) не теряет вирулентности в течение года; низкие температуры его консервируют. Вирус, содержащийся в сыворотке крови больных свиней, хранившейся при температуре 2-4°С, не теряет активности 4-6 мес.. В свиных тушах остается вирулентным после 2-б-мес. хранения в холодильнике при температуре -20-25°С. Хорошо сохраняется в лиофилизированном состоянии при рН между 5 и 10. Быстро инактивируется под действием эфира,хлороформа и дезоксихолата, чувствителен к трипсину и липазам, MgCl2 не оказывает на него стабилизирующего действия. Лучшими дезинфицирующими средствами являются 2%-ный р-р NaOH, хлорная известь 1:20 и 3-6%-ное крезоловое масло. ВКЧС сохраняет вирулентность и АГ-свойства в нативной и лиофилизированной крови при хранении в замороженном состоянии длительное время - 2456 дн (срок наблюдения). Инактивация вируса физическими средствами зависит от среды,содержащей вирус. В культуральной жидкости инфекционность теряется через 10 мин при 60°С, тогда как в дефибринированной крови вирус не инактивируется в течение 30 мин при б8°С. Вирус стабилен при рН 5-10, но при значениях выше и нижеуказанных теряет инфекционность.
Антигенная структура, вариабельность и родство
По вирулентности различают А-, В- и С-варианты вируса. В группу А входят вирулентные эпизоотические штаммы, вызывающие у свиней всех возрастов остро протекающая болезнь, а также лапинизированные и "холодные" варианты культурального вируса. Вирусы подгруппы В вирулентны только для поросят и при циркуляции в стаде вызывают т.н. атипичную или хроническую чуму. К подгруппе Относится американский слабовирулентный шт. 331. Достоверных данных в отношение АГ-вариабельности вируса нет. ариабельность вируса проявляется не только различной вирулентностью для свиней, но и различными АГ взаимоотношениями с вирусом диареи КРС. Установлено одностороннее родство между ВКЧС и вирусом диареи КРС: AT к вирусу диареи КРС нейтрализуют ВКЧС, но AT к ВКЧС не нейтрализуют вируса диареи.
Локализация вируса
Вирус пантропен, накапливается во всех органах и тканях, но преимущественно в лимфоузлах, костном мозге, слизистой оболочке кишечника и эндотелии кровеносных сосудов. Он проникает в организм через кишечный и дыхательный тракты. В тонзиллярных лимфоузлах отмечается наибольшая его концентрация. Возбудитель размножается в лейкоцитах периферической крови. Через 6-10 ч после попадания в организм его можно обнаружить в крови. На 3-й день после подъема температуры тела накапливается там в максимальной концентрации. У поросят, зараженных экспериментально per os,через 7 ч вирус выделяли из миндалин, а через 16 ч - из крови. С 3-го по 7-й день титр вируса, выделяемого из миндалин, крови и селезенки, был наивысшим и составлял 105 БОЕ/мл. В околоушной и поджелудочной железах, подчелюстных,заглоточных, мезентериальных и других лимфоузлах, респираторных путях и кишечном тракте вирус обнаруживали на 3-й день; в ЦНС, сердце, костном мозге,яичниках, матке - на 4-й день после заражения в титрах 103,2-105 БОЕ/мл. Он выявлен также в эпителии миндалин, в слизистой оболочке глотки, почек, мочевого и желчного пузыря, в поджелудочной железе, слюнных железах, надпочечниках,щитовидной железе. В легких вирус локализовался в эндотелии кровеносных сосудов и адвентиции, а также в альвеолярных макрофагах. На 6-й день после заражениявирус из организма больных свиней выделяется с мочой, фекалиями, истечениями износа и глаз. Вирусовыделение начинается в инкубационном периоде и усиливается по мере развития признаков болезни. Выделение вируса прекращается уже через 3дн после исчезновения лихорадки, однако имеются данные о том, что у хронически больных животных вирусоносительство обнаруживают до 95-го дн после заражения.
Доказана трансплацентарная передача ВКЧС в различные периоды супоросности. Поросята после рождения длительное время остаются скрытыми вирусоносителями и служат источником заражения. Свиноматки-носители вируса рождают клинически здоровых, но инфицированных и иммунотолерантных поросят,которые выделяют вирус в больших количествах в течение 4-6 месяцев. Этот феномен хронической инфекции являются факторами персистенции вируса среди популяции свиней. Трансплацентарная передача вируса сопровождается тератогенным действием и высокой перинатальной смертностью. Уровень летальности среди новорожденных поросят находится в прямой зависимости от инфицированности плодов. Все поросята с виремией погибают.
Антигенная активность
В сыворотке кровисвиней-реконвалесцентов не обнаруживают ВНА, ПА и КСА. Получены монАТ,специфичные к 3-м структурным вирусным протеинам: РТ2, Р150 и Р12. ATреагировали только с высоко очищенным вирусом. Выраженный иммунитет развивается у свиней, начиная с 6-8-нед возраста, ВНА появляются на 7-10-й день после инфицирования или иммунизации, достигают максимума через 3-4 нед и сохраняются более года. Пассивные AT у поросят могут сохраняться 2-3 мес.. AT молозива к ВКЧС, продуцированные свиньями, вакцинированными за 55 дн до опороса, характеризовались высокой активностью и коротким периодом полураспада, но подавляли первичную иммунную реакцию потомства на последующую вакцинацию. У свиноматок, вакцинированных не ранее, чем за 86 дн до опороса, они обладали значительной авидностью.
Экспериментальная инфекция. Легко воспроизводится на не иммунных подсвинках массой 40-50 кг при подкожном заражении.
Культивирование
Культивирование вируса в лабораторных условиях на не иммунных свиньях можно проводить практически бесконечно Этот метод дорог и небезопасен Вирус удается репродуцировать также в первичной культуре клеток легких, селезенки, почки и лейкоцитов без выраженного ЦПД. Оптимальный возраст культуры свиных лейкоцитов колеблется от 1 до 5 суток. Максимального уровня титр вируса достигает через 4-8 дн. после заражения. Уровень репродукции различных штаммов вируса в культурах макрофагов интактных ииммунизированных поросят одинаков Он так же размножается в культуре клеток тестикул поросят, вызывая ЦПД при использовании аргинин буферной среды, и в перевиваемой линии клеток почки поросенка (РК-15).
Точно определить инфекционную активность вируса можно методом флюоресцирующих бляшек, поскольку инфекционные титры воспроизводимы и могут быть определены уже через 24 часа после инфицирования культуры Разработан метод титрования вируса путем учета негативных колоний под агаровым покрытием. Подобраны 3 линии клеток, формирующих негативные колонии при культивировании в монослое РК15, КРД 10 и RPTY. Предложен также метод титрования ВКЧС в культуре клеток с помощью феномена экзальтации. В начале культуру инфицируют ВКЧС, а затем (через определенное время) - вирусом НБ (шт. Миадера). Клетки, в которых размножился ВКЧС, под влиянием вируса НБ разрушаются (ЦПД), тогда как клетки,зараженные одним ВКЧС, не изменяются. Вместо вируса НБ можно использовать вирус болезни Тешена Кроме того, предложен тест экзальтации гемагглютинации и ингибиции ЦПЭ с использованием клеток почки свиней и вируса НБ (шт. Саго) Здесь цитопатогенный вирус ингибируется в результате предварительной инокуляции ВКЧС,эта ингибиция сопровождается значительным увеличением образования ГА вируса НБВ место последнего успешно применяли один из штаммов вируса гриппа.
ГА- и гемадсорбирующие свойства ВКЧС - не установлены.
Тератогенные свойства
ВКЧС обладает тератогенными и другими патогенными свойствами в зависимости от стадии беременности, когда происходит встреча матери и плода с вирусом. При инфицировании супоросных маток на 65-й день происходила гибель плодов более чем в 30% случаев. У оставшихся в живых гистерэктомированных плодов обнаруживалась виремия и отсутствовали ВНА. При заражении свиноматок между 94 и 101 дн. супоросности гибели плодов не наблюдалось. Очевидно 65-й день беременности является последним сроком для установления персистентной виремии у плода.
Эпизоотологическая Характеристика
Источники и пути передачи инфекции. Источник инфекции - больные животные, выделяющие вирус во внешнюю среду с мочой, фекалиями и секретами слизистых оболочек глаз и носа, а также реконвалесценты. Здоровые Свиньи, находясь в контакте с больными и пользуясь общим кормлением и водопоем,легко и быстро заражаются. Заражение происходит, главным образом, через пищеварительный тракт с инфицированными кормами и водой, а также через дыхательные пути и поврежденную кожу. Один из основных путей распространения инфекции - завоз продуктов убоя больных чумой свиней и скармливание их животным без надлежащего обезвреживания, а также ввоз в хозяйство свиней в инкубационном периоде болезни и вирусоносителей, занос вируса с грубыми и сочными кормами, зараженными дикими свиньями.
Из неблагополучных хозяйств ВКЧС свободно выносится за 2нед. до появления болезни и после начала ее до установления диагноза, когда животных без ограничения вывозят на мясокомбинаты и в другие хозяйства.Реализация продуктов убоя таких свиней - главная причина распространения чумы в современных условиях. Описана передача ВКЧС комарами. Примерно из 100 комаров разных видов, отловленных в двух неблагополучных по КЧС фермах, готовили суспензии и заражали поросят, В 8 случаях поросята заболевали. Патогенной Оказалась суспензия комаров из родов Aedes, Anopheles, Psorophora и Culex .Наиболее важным аспектом в циркуляции вируса КЧС в природе является трансплацентарная передача полевых и вакцинных штаммов, врожденная персистентная КЧС-инфекция у плодов и новорожденных поросят. Прослеживается тесная связь кругооборота вируса с кругооборотом репродуктивного цикла воспроизводства свиней. Циркуляция вируса в популяции "свиноматка - плод - потомство" является основным связующим звеном естественного кругооборота вируса.
Природная очаговость
Природная очаговость КЧС среди кабанов представляет опасность для промышленного свиноводства возможным вовлечением домашних свиней в цепь циркуляции возбудителя. Появление природной очаговости чумы в стране обусловлено рядом объективных факторов:
- прямыми и косвенными связями между дикими и домашними свиньями вследствие продолжающегося расселения кабанов. Зоологи отмечают, чтосеверная граница ареала кабанов сдвинулась на север европейской части страныдо линии Беломорск - Березняки -Няндома - Котлас - Мураши. Активное расселениекабана идет и в южных районах России при устойчивой общей численностипоголовья; устойчивостью возбудителя КЧС, длительным вирусоносительством, разнообразием путей его передачи от больных кабанов здоровым при непосредственных контактах или через объекты внешней среды,инфицированные выделениями больных, длительным поддержанием вируса в популяциях благодаря конгенитальному заражению плодов;
- ангропогенным воздействием на среду обитания кабанов,приводящим к использованию ими кормов, пищевых отходов, подстилки на полях и фермах и взаимному обмену вирулентным вирусом при наличии больных среди диких и домашних свиней;
- связывающими факторами в распространении возбудителя КЧС между отдельными популяциями кабанов в результате миграции животных (суточный переход достигает 10-20 км).Не исключена в этом процессе роль кровососущих членистоногих. Дополнительным,нередко важным, связующим звеном с домашними свиньями могут быть пищевые отходы вследствие использования человеком мяса кабанов. Болезнь среди кабанов регистрировали с 1901г.
Спектр патогенности в естественных условиях
К ВКЧС восприимчивы домашние свиньи всех пород и возрастных групп, особенно чистопородные, а также дикие кабаны. В лабораторных условиях путем длительных серийных пассажей ВКЧС удается адаптировать к организму кроликов.
Клинические признаки
Инкубационный период в зависимости от вирулентности вируса и чувствительности животных длится 3-9 да, реже - 12,иногда - до 20 дн. КЧС может протекать сверх остро, остро, подостро и хронически. Некоторые исследователи выделяют особую нервную форму, когда доминирующий симптом болезни - поражение ЦНС.
Сверх острое течение болезни наблюдается очень редко и у молодых животных. Оно характеризуется быстрым течением, высокой температурой(41-42°С), угнетенным состоянием, апатией, полным отсутствием аппетита и рвотой, учащенным сердцебиением и дыханием, ярко-красными пятнами на коже. Животные погибают через 1-2 дня.
Острое течение чаще регистрируется в начале эпизоотии. Температура тела повышается до 40,5-41°С,животные неохотно передвигаются, больше лежат. Наблюдают угнетение, слабость,отказ от корма. Развивается гнойный конъюнктивит, появляется рвота, запор, а затем понос (фекалии иногда с примесью крови). Мочеиспускание затруднено. У некоторых животных моча темно-коричневого цвета. Супоросные свиньи абортируют.Нередко возникает слизисто-гнойный ринит, а у отдельных животных - носовое кровотечение. На коже внутренних поверхностей бедер, живота, шеи и у основания ушных раковин появляются пустулы, заполненные желтоватым экссудатом, а несколько позже - точечные кровоизлияния, которые в дальнейшем сливаются и образуют темно-багровые пятна, не исчезающие при надавливании. Прогрессирующая Слабость сопровождается учащенным и затрудненным дыханием, сердечной недостаточностью, в результате кожа пятачка, ушных раковин, живота и конечностей приобретает синюшную окраску. Развивается выраженная лейкопения и резкий сдвиг нейтрофильного ядра до миелоцитов. Перед гибелью температура снижается до 35-36°С. Обычно животные погибают на 7-10-й день.
Нервная форма относится к острому течению болезни и характеризуется судорожным подергиванием отдельных групп мышц, манежными движениями, параличами задних конечностей, нервным возбуждением и апатией,сонливостью. Температура - в пределах нормы или повышена до 40,5-41°С. Смерть наступает довольно быстро - через 24-48 часов.
Подострое течение наблюдается нередко после острого течения,болезнь затягивается до 3 недель. Температура тела при подостром течении несколько ниже, чем при остром. Выздоровление отмечается редко. При затяжном течении чумы наблюдается наслоение вторичных бактериальных инфекций; сальмонеллеза и пастереллеза. В случае осложнения чумы сальмонеллезом местом локализации вторичных поражений является ЖКТ (кишечная форма чумы). Запор, характерный для острого течения чумы, сменяется изнурительным поносом со зловонным запахом и примесью слизи, а иногда крови. Свиньи прогрессивно худеют и болезнь обычно заканчивается гибелью, реже приобретает хроническое течение.
При осложненении чумы пастереллезом поражения локализуются в органах дыхания (легочная форма). У животных наблюдают затрудненное дыхание,кашель, иногда удушье, признаки бронхопневмонии, слизисто-гнойные истечения износа; температура тела выше 40°С. Болезнь чаще всего кончается гибелью животного, нередко наблюдают осложнение чумы сальмонеллезом и пастереллезомодно временно (смешанная форма). И в том и другом случае животные гибнут.
Хроническое течение характеризуется продолжительным течением болезни (несколько недель и даже месяцев), тяжелым крупозно-дифтероидным поражением ЖКТ, гнойно-фибринозным воспалением легких и плевритом. У больных животных наблюдают понижение или потерю аппетита, конъюнктивит, понос, иногда сменяющийся запором, анемию и прогрессирующее исхудание; свиньи превращаются в заморышей. Голова и хвост у них опущены книзу, спина изогнута, заостренный зад отвисает, задние конечности подогнуты под живот. Животные большей частью лежат,зарывшись в подстилку. Температура тела повышена, но нередко повышение температуры отсутствует. Часто отмечаются некрозы кончиков ушей и хвоста. При хроническом течении появляются благоприятные условия для развития вторичных инфекций: сальмонеллеза и пастереллеза. Однако часто стало появляться субклиническое и хроническое течение, характеризующееся нарушением функции воспроизводства(бесплодие, аборты, мертворождаемость). Одной из причин, способствующих появлению этих форм, является размножение вирулентных штаммов в недостаточно иммунном организме, в частности, у привитых инактивированными вакцинами.Мертворождаемость, отставание в росте свидетельствуют о заражении плодов через плаценту. Конгенитальная передача вируса может сопровождаться персистентной виремией в течение всей жизни животных или очень длительного периода. В первые недели жизни у поросят, родившихся с персистентной виремией, не находят никаких видимых признаков болезни, но такие животные передают вирус другим. Водном помете могут быть поросята инфицированные и не инфицированные. Клинически невозможно отличить поросят, имеющих вирус в крови, от здоровых животных. Только через некоторое время наблюдали хроническое течение болезни, отставание в росте и гибель в возрасте 3-8 нед. У поросят описан врожденный тремор мышц,связанный с хроническим течением КЧС.
Патологоанатомические изменения
Патологоанатомические изменения при КЧС очень вариабельны и зависят от течения болезни и наличия осложнений секундарной инфекцией(сальмонеллез, пастереллез и др.)
Наиболее типичные изменения встречаются у подсвинков и взрослых животных. Острая(септическая) форма чумы протекает обычно без осложнения вторичной инфекцией.На краях век и в углах глаз образуются коричневые корочки. Конъюнктива, слизистые оболочки носа и рта, цианотичны. Кожа ушей, шеи, живота, внутренней стороны бедер пятнисто или диффузно окрашены в багрово-красный цвет, видны точечно-пятнистые кровоизлияния. Обращает внимание выраженные явления геморрагического диатеза в различных органах. Наиболее характерные изменения в лимфоузлах,селезенке и почках. Лимфоузлы, преимущественно головы и шеи, набухшие, сочны, красного цвета снаружи и мраморного вида на разрезе. Селезенка обычныхразмеров или несколько уменьшена, часто (в 40-50% случаев) с инфарктами покраю органа. Почки обычно бледные, с многочисленными точечными кровоизлияниями в корковом слое. Геморрагии встречаются также в слизистой оболочке лоханки,мочеточников и мочевого пузыря. Надпочечники набухшие, полнокровны. В сердце и печени иногда регистрируют кровоизлияния. В желудке и кишечнике острое,катаральное, реже крупозно-геморрагическое воспаление слизистой оболочки с кровоизлияниями, гиперплазия лимфоидных (солитарных) фолликулов и пейеровых бляшек. Легкие полнокровны, иногда с очагами серозно-катаральной или крупозно-геморрагической пневмонии. Головной и спинной мозг и их оболочки отечны, полнокровны, мес.тамис точечными кровоизлияниями. При чуме, осложненной пастереллезом (грудная форма), основные изменения наблюдают в органах грудной полости: крупозно-геморрагическую пневмонию, множественные некрозы,серозно-геморрагический или фибринозный плеврит и перикардит, интенсивные кровоизлияния на серозных покровах грудной полости, а также на слизистой гортани и трахеи.Встречаются кровоизлияния в коже, в почках и в кишечнике, набухание и изъязвление фолликулов толстого кишечника.
При чуме, осложненной сальмонеллезом (кишечная форма),болезнь протекает преимущественно хронически и характеризуется язвенно-некротическими процессами в пищеварительном тракте (глотке, миндалинах,желудке и кишечнике) Наиболее часто поражаются слепая и ободочная кишки, где находят дифтерические "бутоны" и язвы, реже диффузное дифтерическое воспаление. Кроме того, отмечают экзему и некрозы кожи, очаги бронхопневмонии,фибринозный плеврит и перикардит, а также характерные для острой чумы изменения в лимфоидных органах и почках
Гистологические изменения при КЧС не специфические
Большая часть процессов, на которых может базироваться гистологическая диагностика,очень легко распознается на вскрытии (геморрагический лимфоденит, инфаркт селезенки и др. ) Определенную диагностическую ценность представляют лишь изменения кровеносных сосудов, преимущественно в легких, с которыми связано формирование ряда характерных для чумы патологических процессов в различных органах (лимфоузлах, селезенке, почках, ЦНС и др.) В лимфоузлах устанавливают полнокровие сосудов, гомогенизацию, фибриноидное набухание и некроз стенок сосудов, микронекрозы лимфоцитов, очаговые скопления плазмоцитов, чаще по ходу сосудов. В селезенке, в зоне инфаркта, отмечают некроз ткани, а вне зоны - кровоизлияния, очаги кариорексиса лимфоцитов и небольшие группы незрелых клетки лимфоидного ряда В почках зернистая дистрофия и некроз канальцевого эпителия, гломерулонефрит и кровоизлияния в виде петехий и экхимозов во всех слоях, а также в слизистую лоханки мочевого пузыря. В большинстве случаев (70-90%) в ЦНСобнаруживают негнойный лимфоцитарный энцефаломиелит, характеризующийся наличие периваскулярных лимфоцитарных инфильтратов, очаговой пролиферации клетки микроглии (глиальных узелков) и дистрофии ганглиозных клеток.
Патогенез
При КЧС патогенез необходимо рассматривать в 2-хаспектах на клеточном уровне и на уровне целого организма. Как установлено, тип взаимодействия вируса с клетками - персистентный, проникновение вируса вклетку - рецептор-зависимое. Несмотря на продуктивную инфекцию и образование инфекционного вируса, возбудитель не оказывает ЦПД на зараженную клетку и,следовательно, не ясен патогенетический механизм in vitro. Система мононуклеарных фагоцитов (СМФ) обеспечивает диссиминацию вируса в организмесвиней Вирусный патогенез на уровне целого организма представляется так инфект(ВКЧС) - ворота инфекции (миндалины и носоглотка) - первичная виремия (16-24 ч после заражения) - максимальное накопление ВКЧС в органах иммунной системы(лимфоузлы, селезенка, костный мозг, пейеровы бляшки) На 4-6-е сут. - вторичная инфекция С 4-х сут. после инфицирования - вирусовыделение с секретами и экскретами.
Патогенез КЧС можно рассматривать как вирус индуцированное нарушение ферментных систем у больных животных. В организме вирус размножается в лимфоцитах лимфоузлов, селезенки, костного мозга и эндотелии кровеносных сосудов, вызывая дистрофические и некротические изменения. Под влиянием вируса развиваются некротические изменения и основного вещества стенок кровеносных сосудов микроциркулярного русла различных органов в виде мукоидного и фибриноидного набухания и некроза, накопления кислых мукополисахаридов В результате этого сильно повышается проницаемость стенок сосудов, что приводит квозникновению кровоизлияний, отеков, некродистрофических и воспалительных процессов в различных тканях и органах. Размножаясь в клетках иммунной системы и вызывая их разрушение, вирус сильно снижает иммунные свойства организма, что способствует активации вторичной инфекции (пастерелл, сальмонелл) и отягощениюосновного процесса.
В патогенезе болезни основными факторами ее развитияявляются химотрипсин и другие субстанции нормальной ткани поджелудочной железыХимотрипсин является одним из АГ, индуцированных вирусом, поэтому КЧС можнорассматривать как инфекцию, при которой происходит расстройство ферментныхсистем организма с повышенной продукцией химотрипсина. Известно, что макрофаги(МФ) являются не только эффекгорной клеткой иммунной системы, но исекреторной, обладающей значительным цитолитическим потенциалом (протеазы исвободные радикалы кислорода). Неспецифическая цитотоксичность МФ селезенкирезко возрастает при персистенции вирусов в клетках. Ингибиция фагоцитарнойфункции и активация секреторной функции МФ под действием репродукции ВКЧС является характерным проявлением прямого ЦПД возбудителя как in vitro, так и invivo. В то же время ВКЧС не оказывает прямого ЦПД на лимфоциты, так как все попыткипоказать in vitro тяжелые нарушения реактивности Т- и В-лимфоцитов имелиотрицательный результат. Поэтому поражение клеток (некроз лимфоцитов) при КЧСявляется результатом непрямого действия вируса, и развивается в результате активации цитолитического потенциала зараженных клеток-мишеней (МФ) принепосредственным контакте с другими клетками (лимфоцитами, эпителиальными,эндотелиальными и др.). Кроме того, макроорганизм в отличие от культивируемыхклеток имеет систему кровообращения. Следовательно, циркулярные нарушениякровообращения, вызванные непрямым вирусиндуцированным поражением стеноксосудов и воспалительной реакцией, играют важную роль в патогенезе КЧС,вызывая отек, геморрагии, инфаркты
Существуют 6 концепций патогенетического механизма при КЧС:
- КЧС как иммунопатологический процесс циркулирования в кровикомплексов АТ-АГ и их оседания на поверхности сосудов;
- КЧС как процесс нарушения коагуляционных механизмов крови;
- КЧС как сверхострый паралимфобластический лейкоз;
- КЧС как процесс вирусиндуцированного расстройства ферментныхсистем организма с гиперпродукцией химотрипсина;
- КЧС как процесс вируспоражения надпочечников сгиперпродукцией глюкокортикостероидов из гиперплазированной корковой зоны;
- КЧС как процесс вирусиндуцированной активации клеток СМФи(или) нейтрофилов с гиперпродукцией циготоксинов-протеаз и свободных радикаловкислорода.
Клетки, зараженные ВКЧС, несут очень мало вирусного АГ насвоей поверхности, поэтому инфицированные клетки могут избегать иммунной атакиклеток хозяина. Имеется ряд фактов, подтверждающих патогенетическое значениепротеаз - выраженное болеют КЧС более упитанные животные, получающие богатыйбелками корм (опыты на крысах показали, что у них при таком режиме кормленияусиливается образование протеаз). Установлены резкие возрастные колебанияуровня химотрипсина в крови и соответствующие изменения уровня лимфоцитов.Одним из путей, приводящих к развитию поражений при КЧС, являются нарушения всистеме свертывания крови, в частности развитие тромбоцитопении и изменениекоагуляциоиных параметров. Вследствие максимальной активности коагуляционнойсистемы развивается синдром диссиминированного внутрисосудистого свертываниякрови, приводящий к появлению геморрагий. Одна из теорий состоит в том, чтопатологические процессы и летальный исход определяются разрушением В-лимфоцитовили В-лимфобластов в зародышевых центрах лимфоузлов.
Диагноз ставят наосновании эпизоотологических данных, симптомов болезни, патологоанатомическихизменений и результатов лабораторных исследований. Эпизоотические, клиническиеи патологоанатомические данные зависят от восприимчивости свиней, вирулентностиштамма и комплекса мероприятий по профилактике КЧС.
Если в очаге штамм вируса вирулентный, поголовье свиней неиммунное, то болезнь характеризуется высокой контагиозностью, большейсмертностью, гипертермией, геморрагическими поражениями кожного покрова,признаками поражения органов ЖКТ и ЦНС. Обращают внимание выраженныйгеморрагический диатез в различных органах, мраморность лимфоузлов, инфарктыселезенки, кровоизлияния в почках на фоне их анемии, катарально-геморрагическийгастроэнтерит, лимфоцитарный энцефаломиелит. Однако частая вакцинация свинейпротив чумы создает иммунный фон, влияющий на симптомы болезни и характерпатоморфологических изменений. При хроническом течении характерными изменениямиявляются очаговый дифтеритический налет (бутоны), коричневая экзема, фибринозныйплеврит и перикардит, некроз миндалин. Хроническая болезнь часто протекает нафоне других инфекций. Правильный диагноз может быть поставлен тольколабораторньми методами.
Экспресс-методы обнаружения вируса КЧС
Для быстрогообнаружения ВКЧС в тканях с помощью ПЦР из образцов тканей животных фенольнымметодом выделяют препараты РНК, подвергают обратной транскрипции иамплифицируют в ПНР. Используемые "гнездовые" праймеры позволяютамплифицировать разные изоляты ВКЧС. ПЦР обладает высокой чувствительностью испецифичностью и позволяет дифференцировать различные пестивирусы.
Выделение вируса
Взятие и подготовка материала. Для выделения вируса берут пробы крови, кусочки селезенки, миндалин, лимфоузлов,грудной кости, почек и легких от 2-3 животных в первые 2 ч после гибели илиубоя больных в агональном состоянии. Материал отбирают в стерильные флаконы,закрывают резиновыми пробками, флаконы обрабатывают снаружи 5%-ным р-ромхлорамина или осветленным 20%-ным р-ром хлорной извести, обертывают марлей,смоченной дезинфицирующим р-ром, и помещают в полиэтиленовый пакет. Взятыйпатматериал помещают в термос со льдом, опечатывают и отправляют с нарочным влабораторию с соответствующим сопроводительным документом. В лаборатории изкаждой пробы готовят 20%-ную суспензию на 0,85%-ном р-ре NaCI, которую триждызамораживают и оттаивают, центрифугируют при 3-4 тыс. мин-1 20-30 мин.Надосадочную жидкость обрабатывают антибиотиками 1ч при 37° С и используют длявыделения вируса.
Индикация и идентификация вируса Гистологическиеисследования
Проводят с целью обнаружения специфических изменений нервныхтканей. От павших или убитых свиней берут кусочки полушария головного мозга,мозжечка, аммоновых рогов, спинного мозга в различных участках. Гистологическиепрепараты окрашивают гематоксилин-эозином. В большинстве случаев (70-93%) в ЦНСобнаруживают негнойный лимфоцитарным энцефаломиелит, характеризующийсяпериваскулярными лимфоцитарньми инфильтратами, очаговой пролиферацией клетокмикроглии (глиальных узелков) и дистрофией гангаиозных клеток. В срезах,приготовленных из лимфоузлов, сердечной мышцы и печени, можно обнаружить присутствиеацидофильных внутриядерных телец-включений, несколько меньших, чем ядрышки. Влимфоузлах их находят на 6-12-й день после заражения.
ВКЧС обладает выраженным гематотропизмом в отношении костного мозга, содержащего большее количество бластных клеток, чем лимфоузлы и селезенка. Поэтому костный мозг поражается первым; ингибируются миелопоэтические и эритропоэтические клетки и пролиферируют крупные клетки сбазофильной цитоплазмой. Наряду с этим обнаруживают картину глубокого цитолизаи дистрофию лимфопоэтических органов.
При подозрении на чуму для уточнения диагноза несколько тяжелобольных животных убивают и исследуют мазки из костного мозга груднойклетки.
Биопроба
Из благополучного по инфекционным болезнямхозяйства берут поросят в возрасте 2-3 мес.. массой 20-30 кг. В качестве материалаиспользуют 10%-ную суспензию, приготовленную из органов (селезенки, лимфоузлов,костного мозга) или крови от павших животных. Суспензию обрабатываютантибиотиками, выдерживают не менее 4 ч при 4°С, центрифугируют и надосадочнуюжидкость используют для заражения животных. Трем поросятам вводят подкожно по1 мл крови или по 2 мл суспензии органов. Двум животным исследуемый материал неинокулируют, содержат их отдельно для контроля. Двум поросятам, иммунным кВКЧС, вводят исследуемый материал в тех же дозах с целью дифференциальнойдиагностики в отношении АЧС. За всеми животными наблюдают 21 день и ежедневноизмеряют температуру тела.
Диагноз считают положительным, если 2 из 3-х неиммунныхпоросят заболевают, проявляя симптомы болезни, и погибают, а 2 иммунныхостаются здоровыми или проявляют незначительные и кратковременные (1-4 дн.)признаки болезни слабой интенсивности (повышение температуры тела не выше41°С). Однако следует иметь ввиду, что при отсутствии реакции у восприимчивыхживотных или в случае ее недостаточной выраженности, нельзя с уверенностьюисключить присутствие вируса в исследуемом материале. Отрицательный результатзаражения может быть следствием либо слишком малого количества в нем вируса,либо слабой вирулентности последнего. Поэтому следующим шагом являетсяповторное, спустя 3-6 нед после инокуляции исследуемого материала, заражение(реинфекция) подопытных свиней на этот раз вирусом с заведомо известнойвирулентностью. Отсутствие у животных реакции на это заражение свидетельствуето приобретении ими иммунитета в результате первой инокуляции (бессимптомногопереболевания) и указывает на присутствие вируса в исследуемом материале.Одновременно с проведением 2 пробы заражают дополнительно 2 восприимчивыхпоросят (контроль) вирусом, использованным для реинфекции.
Иногда биологическая проба себя не оправдывает или дает неясные результаты при выделении штаммов вируса, вызывающих легкоезаболевание. Такие штаммы у инокулированных поросят вызывают хроническуюболезнь. Дело осложняется тем, что штаммы со слабой вирулентностью могут необладать иммунизирующими свойствами, а это не позволяет уточнить диагноз прииспользовании дополнительного контрольного заражения вирулентным штаммом(реинфекции). При диагностике заболевания, обусловленного такими штаммами могутпонадобиться более молодые животные и дополнительные пассажи для повышениявирулентности.
Предложена шкала оценки вирулентности полевых штаммов ВКЧС:
- слабовирулентные (патогенные лишь для поросят-сосунов) неиммунизирующие штаммы. Поросята-сосуны заболевают в первые дни жизни исмертность их велика, поросята-отьемыши (12-15 кг) реагируют только в определенныедни подъемом температуры тела, не приобретая иммунитета;
- слабовирулентные (патогенные для молодых животных)иммунизирующие штаммы. У животных массой 15-20 кг развивается хроническаяболезнь, подсвинки массой 35 кг реагируют подъемом температуры тела, продолжающимсянесколько дней. На вскрытии обнаруживаются незначительные точечныекровоизлияния. Животные приобретают иммунитет;
- сильно вирулентные штаммы вызывают у животных массой 30 кг острое заболевание,смертность 40% и больше. На вскрытии характерны геморрагические изменения.
Тест модуляции фагоцитарной активности макрофагов
Дефицитфагоцитарной функции приводит к нарушению локальных иммунных реакций сразвитием воспалительных процессов на слизистых оболочках. При КЧС происходитлокализация фагоцитарной функции лейкоцитов: при репродукции вакцинного шт. ЛК-ВНИВВиМ снижается процент и индекс фагоцитоза нейтрофилов и макрофагов, апри репродукции вирулентного вируса шт. Ши-Мынь повышается процент и индексфагоцитоза нейтрофилов и снижается таковой у макрофагов. При КЧС in vivo и invitro фагоцитарная активность лейкоцитов крови кратковременно (до 4 сут.)снижается при инфицировании вакцинным штаммом и повышается у макрофагов приинфицировании вирулентным штаммом ВКЧС. Установленный в инфицированныхклетках-мишенях цитопатический эффект, выражающийся в модуляции фагоцитарнойактивности свиных макрофагов, используют в диагностике КЧС..
Серологическая идентификация
Иммунофлюоресценция. Из проб органов (лимфоузлы, селезенка,почки, миндалины) готовят замороженные срезы. Из проб костного мозга илейкоцитарного концентрата - мазки. Для приготовления последних берут груднуюкость, делают продольный разрез и вынимают красный костный мозг, из которогоделают несколько мазков. Для приготовления мазков из лейкоцитарного концентратаот больных или подозреваемых в заболевании свиней берут 15 мл крови сантикоагулянтом, энергично встряхивают, оставляют на 1 ч при комнатнойтемпературе, затем отбирают плазму с лейкоцитами и центрифугируют 10 мин при1000 мин-1, из осадка лейкоцитов (беловатый осадок) делают 2-3 мазка.Приготовленные препараты (срезы и мазки) фиксируют в охлажденном ацетоне 10мин, после испарения ацетона промывают 15-20 мин в ФБР рН 7,2 и окрашивают при37°С 30 мин конъюгатом в рабочем разведении, к которому добавляют красительЭванса в соотношении: 3 части конъюгата и 1 часть красителя, затем препаратпромывают в фосфатном буфере и оставляют на 10 мин в дистиллированной воде.После частичного подсушивания на воздухе на препарат наносят забуференныйглицерин (9 частей глицерина и 1 часть ФБР рН 8), покрывают покровным стеклом имикроскопируют. Аналогично ставят контроли: а) исследуемый материал и нормальный конъюгат с красителем Эванса; б)неинфицированный материал и специфический конъюгат с красителем Эванса. Примикроскопии фон препарата флюоресцирует красно-оранжевым цветом, ядра клетоктемные, специфическое свечение характеризуется зеленым цветом цитоплазмы. В мазкахиз красного костного мозга и лейкоцитарного концентрата специфическаяфлюоресценция отличается большой яркостью и количеством флюоресцирующихклеток. Специфическое свечение в цитоплазме даже в отдельных клеткахпрепаратов, полученных от подозрительных по заболеванию животных, указывает наналичие вируса КЧС. В контрольных препаратах подобного свечения не должнобыть.
Указанный метод отличается специфичностью и быстротой.Однако во избежание погрешностей метода при внедрении его в лабораторииследует иметь в виду, что специфичность результатов зависит от следующих факторов: качества сыворотки-маркера (она должна иметь высокие титры, бытьмоновалентной, полученной от свиней, не обработанных другими АГ), качестваисследуемого материала (должен быть отобран не позже 2-3 ч после смертиживотного, фиксирован в ацетоне или замораживанием и сразу же отправлен на исследование).В сопроводительном письме необходимо указывать клиническую и эпизоотологическуюхарактеристику болезни, даты и названия прививок. При учете реакции следуетзнать, что вакцинный вирус сохраняется в вакцинированных свиньях до 15 дн послевакцинации и в ИФ не дифференцируется от полевого вируса.
РНГА. Для обнаружения АГ вируса в патологическом материалеиз органов и тканей свиней используют следующие компоненты: а)АТ-эритроцитарный диагностикум; б) специфический АГ - вирус-вакцина КЧС; в)нормальный (контрольный) АГ; г) 1%-ный р-р нормальной лошадиной сыворотки взабуференном физиологическом р-ре с рН 7,2; д) фор-малинизированные итанизированные эритроциты барана; е) исследуемый материал.
РНГА ставят микрометодом в объеме 0,075 мл с помощьюаппарата Такачи или Титертек. Готовят двукратные разведения исследуемогоматериала (от 1:2 до 1:512) в объеме 0,05 мл и такие же разведения контрольныхАГ (специфического и нормального). Затем во все луночки вносят 0,025 мл 3%-нойсуспензии эритроцитарного диагностикума. Кроме того, ставят дополнительноконтроли; а) 0,05 мл 1%-ного р-ра нормальной сыворотки лошади и 0,025 млэритроцитарного диагностикума; б) 0,05 мл исследуемого материала в разведенияхи 0,025 мл формалинизированных и танизированных эритроцитов. После этогопластинки встряхивают и оставляют на 1,5-2 ч при комнатной температуре. Учетпроводят в крестах. РНГА считают положительной при обнаружении агглютинации неменее чем на три креста в разведениях 1:8 и выше.
РДП и ИЭОФ. Реакции различаются методами получения линийпреципитации: в РДП это происходит посредством свободной диффузии р-ров АГ и ATиз лунок в агаровом геле равномерно во все стороны, а в ИЭОФ АГ и AT движутсястрого навстречу друг другу под действием электрического поля, в результатечего увеличивается их концентрация в месте встречи и там образуются болеевыраженные полосы преципитации.
Для постановки ИЭОФ необходим специальный прибор дляэлектрофореза, дающий регулируемое напряжение постоянного тока до 300В. ИЭОФ внесколько раз чувствительнее метода РДП, требует незначительного количестваматериала и позволяет получать результаты через 30 мин. Метод стандартизован,описана методика приготовления агарозного геля. Он используется для выявленияАГ ВКЧС в мезентериальных лимфоузлах и суспензии ткани поджелудочной железы приклинических случаях болезни.Данный метод позволяет выявлять и специфические AT.Метод быстрый, легко осуществим и более чувствителен для лабораторнойдиагностики КЧС, чем РДП.
Серодиагностика и ретроспективная диагностика
В настоящее время в лабораторной диагностике КЧСиспользуются три метода обнаружения специфических AT к ВКЧС: реакциянейтрализации флюоресцирующих микробляшек (РНФБ), реакция непрямой ИФ инепрямой вариант твердофазного ИФА. Наиболее эффективными методами обнаруженияспецифических AT к ВКЧС являются РНФБ и ИФА. Эффективность обнаружения AT кВКЧС в ИФА по сравнению с РНФБ составляла 96,5%. На основании этих данныхнепрямой вариант ИФА рекомендован для обнаружения специфических AT к ВКЧ.
НИФ. НИФ применяется для выявления и титрования AT всыворотках крови переболевших свиней. Используют зараженные вирусомперевиваемые клетки (РК-15) на стеклышках, на которых титруют испытуемыесыворотки в 2-кратных разведениях от 1:20 до 1:640 в непрямой ИФ пообщепринятой методике с использованием во втором этапе реакции антисвиногоФИТЦ-Ig. Титром AT к КЧС считают последнее разведение сыворотки, обеспечивающеезеленое свечение (на 2 креста) диффузного цитоплазматического АГ вируса приотсутствии подобного свечения в контролях с интактными тест-объектами и нормальнойсвиной сывороткой.
Реакция нейтрализации флюоресцирующих бляшек (РНФБ). Вкачестве чувствительной системы необходимо использовать перевиваемую культуруклеток РК-15, выращенную на покровных стеклах в пробирках. РНФБ проводятмикрометодом, используя пластиковые панели Titertek. Суспензию клеток (в 1 мл10-800 тыс. клеток) готовят на среде Игла (MEM) с 5% фетальной сыворотки кровиКРС с добавлением буфера HEPES. Постановка микрометодом РНФБ болеепроизводительна, чем использование макрометода (28). Данный метод может успешноприменяться и для титрования специфических AT. Пробы сывороток крови берут отживотных не ранее 15 дн. после клинического выздоровления. Передиспользованием их инактивируют при 56°С 30 мин. Сыворотки разводят от 1:2 до1:2560 и смешивают с равным объемом вакцинного вируса в количестве 100 ККИД5о(клеточно-культуральных инфекционных доз), встряхивают и выдерживают 60 мин при37°С. Каждое разведение сыворотки с вирусом вносят по 0,4 мл в 4 пробирки скультурой клеток РК-15 на стеклышках. Адсорбируют 2 ч при 37°С. Смесьсыворотка-вирус сливают, отмывают клетки средой, заливают 2 мл поддерживающейсреды и инкубируют при 37°С. Реакцию учитывают через 48 ч инкубации. Препаратывынимают из пробирок, ополаскивают в 0,01 М ФБР рН 7,2-7,4 и обрабатывают, какуказано выше. Реакция сопровождается соответствующими контролями (смесь вирусасо средой, гипериммунной и нормальной сыворотками и незараженная культураклеток). Отсутствие флюоресцирующих микробляшек (при наличии их в контролевируса в смеси с питательной средой и нормальной сывороткой) в препаратахВКЧС, обработанных гипериммунной и испытуемыми сыворотками в разведении 1:2 ивыше, указывает на наличие в материалах специфических AT. Титром AT считают топредельное разведение сыворотки, при котором наблюдается полное подавлениеобразования флюоресцирующих микробляшек.
Во избежание получения ложных результатов при использованиикультуры клеток необходимо добавлять в среду бычью сыворотку, свободную отвируса диареи КРС и AT. BHA выявляются через 21 день после заражения.Обнаружение их с помощью непрямой ИФ в культуре клеток широко применяли в СШАна последних этапах программы искоренения болезни. Однако при интерпретациирезультатов следует учитывать частые случаи инаппарантной инфекции у свиней,вызванной серологически родственным вирусом диареи КРС, поэтому всеположительно реагирующие сыворотки свиней необходимо исследовать и на вирусдиареи.
Для массового обследования свиней на субклиническую инфекциюКЧС в ФРГ предложен тест, сочетающий РН с ИФ. В качестве тест-системыиспользуют культуру клеток РК-15. Если у одной или нескольких свиноматокотдельного стада в сыворотке крови обнаруживают BHA, всех поросят убивают споследующим исследованием органов ИФ.
При исследовании проб сывороток из неблагополучных хозяйствв РН (с 200-300 БОЕ патогенного шт. Альфорт 331) до 50% их оказалосьположительными. Наличие AT свидетельствовало о носительстве вируса. Вируссмогли выделить только у молодых поросят.
Описана усовершенствованная методика выявления BHA к ВКЧС, вкоторой постановка теста значительно облегчена за счет использованияцитолитического штамма вируса, выделенного из персистентно инфицированнойперевиваемой культуры клеток JB-RS-2 и индуцировавшего четкое ЦПД в несколькихперевиваемых линиях клеток почки поросенка. Реакцию ставят в культуре клетокРК-15 на микропанелях при 38°С в термостатах с подачей СО2. Повоспроизводимости и чувствительности методика не уступает реакции с использованиемметода ИФ AT, но требует значительно меньшего труда. Предлагаемый методобладает рядом преимуществ: исключает необходимость использования ИФ; учетрезультатов можно проводить без микроскопа; реакцию ставят микрометодом;используемый вирус аттенуирован. Для постановки РН необходимо вначале провестититрование ВКЧС.
ИЭОФ. Используется в 1%-ной агарозе как диагностический привыявлении AT к ВКЧС в сыворотках зараженных свиней. Для исследования применяетсяАГ, экстрагированный из зараженных ВКЧС клеток РК-15. Показано, что этоткультуральный АГ ВКЧС идентичен преципитирующему АГ вируса, экстрагированногоиз ткани селезенки зараженных свиней. Обнаружено, что ПА к ВКЧС появляются всыворотках через 2-3 нед. после заражения животных слабовирулентными штаммамиили модифицированным живым вакцинным штаммом. Выявлено, что метод ИЭОФ в 2-16раз чувствительнее, чем иммунодиффузия в агаровом геле. Несмотря на меньшую егочувствительность по сравнению с РН, результаты, полученные с помощью ИЭОФ,хорошо согласуются с результатами, полученными методом подавлениябляшкообразования. Считается, что ПА к ВКЧС могут персистировать до 3 лет после1-кратной вакцинации шт. С. Методом ИЭОФ невозможно было дифференцировать AT кВКЧС от AT к вирусу диареи КРС; при получении положительных результатовнеобходимо сочетать его с РН.
ИФА в непрямой модификации. На миллипоровские фильтры (типОН, диаметр пор 0,3 мм),диаметр которых равен 0,6 см,смоченные р-ром АГ ВКЧС, наносят свиные сыворотки. Затем фильтры инкубируют вр-ре кроличьего IgG (против IgG свиньи), меченого пероксидазой хрена RZ=3,0.Активность связанной пероксидазы определяют в р-ре субстрата3,3-диаминобензидина. Опытные образцы окрашивались в коричневый цвет,контрольные оставались бесцветными. Реакция громоздкая.
ELISA. Разработан метод определения AT к ВКЧС намикроплатах, поддающийся автоматическому анализу. Описана методика полученияочищенного и концентрированного АГ для теста ELISA из шт. Альфорт, размноженногов культуре клеток РК-15. Результаты ELISA и РН близки. ELISA легок ввыполнении, дешев, позволяет быстро исследовать большое количество образцов,высокочувствителен и рекомендован в качестве метода оценки прикрупномасштабных обследованиях.
С использованием иммуноглобулинов баранов, инфицированныхВКЧС, разработана технология изготовления ИФ-конъюгатов, пригодных длявыявления вирусного АГ в патологическом материале. При постмортальнойдиагностике вирус выявляется со 100% эффективностью без биологическогонакопления. При экспериментальном заражении вирус в пробах мочи и кровиобнаруживали через 8-10 ч, при контактном заражении - через 72-96 ч.Положительные результаты при индикации ВКЧС в объектах ветеринарного надзора(зерно, почва, вода) получены при концентрации вируса, превышающей 100 ИД. Показаноуспешное применение ИФА для выявления ВКЧС в культуре клеток РК-15.
Описано получение монАТ для диагностики КЧС на мышах линииBALB/c 4-кратно иммунизированных ВКЧС (шт.Альфорт). Клетки селезенки мышей"сливали" с миеломными клетками Sp2/0. Полученные гибридомыкультивировали в 20% среде ДМЕМ Ну-Нт при 37°С в атмосфере 5% С02.Продуцирующую специфические AT культуру дважды субклонировали и послеопределения изотипа AT инокулировали интраперитонеально мышам BALB/c.Образующаяся асцитная жидкость содержала высокие концентрации монАТ, которыепосле соответствующей очистки конъюгировали пероксидазой хрена.
Разработан способ изготовления иммуноферментных коньюгатовдля ИФА с использованием монАТ к ВКЧС с сохранением активности фермента ивысокой специфической активностью иммуноглобулина, а также методфлюоресцирующих зондов (МФЗ), который не уступал по чувствительности испецифичности МФА. Разработан метод выявления ВКЧС методом молекулярной гибридизациии ПЦР.
Дифференциальная диагностика
КЧС необходимо отличать от африканской чумы, пастереллеза,сальмонеллеза, рожи, БА, ВД-БС, парагриппа и гриппа.
При африканской чуме ярче выражен геморрагический диатез,увеличена и размягчена селезенка, полнокровие и кровоизлияния в почках. Чащепоражаются, имея вид кровяных сгустков, портальные, почечные и брыжеечныелимфоузлы. Сильно выражен отек интерстициальной ткани легких, скопление вгрудной полости кровянистой жидкости. Редко отмечают инфаркт селезенки, постоянно- тотальный распад лимфоцитов и тканей лимфоидных органов. Для дифференциацииставят тест перекрестного иммунитета, тест гемадсорбции и РИФ. Пастереллез, какправило, не принимает характера эпизоотии, поражает преимущественно взрослыхживотных. Для него характерны отек подкожной клетчатки подчелюстногопространства, распространяющийся на шею и глотку, серозный лимфаденит,фибринозно-некротизирующая пневмония, слабо выраженный геморрагический диатез.Кроме того, обнаруживают возбудителя при бактериологическом и биологическомисследованиях. Рожа обычно возникает в летний период года и характеризуетсязастойными явлениями кожи (рожистая эритема) и во внутренних органах,увеличением селезенки, гломерулонефритом и катаральным гастроэнтеритом. Рожу свинейдиагностируют выделением возбудителя. Не исключено одновременное течение чумыи рожи. В этом случае диагноз ставят на основании биологической пробы на чумуи бактериологического исследования на рожу. Сальмонеллез наблюдают спорадическии энзоотически среди молодняка 1-5-мес. возраста. Характеризуется слабымгеморрагическим диатезом, развитием в толстом кишечнике плоских рыхлых струпьеви язв, а не "бутонов", очаговыми некрозами печени. Результатыбактериологических исследований являются также основанием для дифференциацииКЧС. Грипп и парагрипп свиней исключаются вирусологическим исследованиемматериала, взятого из верхних дыхательных путей (наличие ГА вируссодержащегоматериала в первых пассажах на КЭ, гемадсорбции в культуре ткани,цитоплазматических включений при ри-ноцитоскопии). Болезнь Ауески чащенаблюдается среди поросят. Проводят вирусологические исследования и биопробуна кроликах. Вирусную диарею уинфицированных устанавливают с помощью ПЦР, поскольку большой неструктурныйпротеин пестивирусов 125 кД высоко консервативен, а мажорный протеин конвертаgm53 четко различается у ВКЧС и диареи КРС.
Иммунитет испецифическая профилактика. Животные-реконвалесценты приобретают стойкийиммунитет, продолжающийся несколько лет. Пассивный иммунитет непродолжителен -до 10-12 дней.
Применение живых вакцин. Иммунитет при КЧС обусловлен ВНА.Иммунные реакции, направленные на цитолиз инфицированных клеток, не «работают»при КЧС из-за отсутствия экспрессии вирус специфических белков на клеточной поверхности. Однако формирование резистентности к заражению вакцинированных свиней происходит до выявления ВНА. Лейкоциты и лимфоциты иммунизированных свиней способны лизировать аутогенные клетки-мишени (лейкоциты),интегрировавшие вирионы КЧС. Однако эти же клетки либо вовсе не вызывали цитолиз не зараженных лейкоцитов, либо лизировали их в меньшей степени. Поэтому весьма вероятно, что в защите от КЧС наряду с нейтрализацией вируса AT важнуюроль играют иммунологические реакции, опосредуемые клетками, в частности ЕК (естественные киллеры) и ЦТЛ (цитотоксические лимфоциты). С 70-х гг. в арсенале средств специфической профилактики КЧС первое мес.то занимают живые вакцины изшт. К и ЛК-ВНИИВВиМ. Лучшая из отечественных - вакцина ЛК-ВНИИВВиМ, получена на основе шт. К ВКЧС, который репродуцируется в гетерологичной системе - культуре клеток тестикулдрной ткани ягнят. Препарат обладает высокой иммуногенностью иполностью лишен вирусных контаминантов, патогенных для свиней. Вакцина не уступает по активности лучшим мировым аналогам - вирус вакцине GPE (Япония) иPhiverval (Франция), но и превосходит их по универсальности применения и потенциальной безвредности. Все характеристики вирус-вакцины ЛК-ВНИИВВиМ соответствуют требованиям Европейской фармакопеи и общепризнанным мировым стандартам. С помощью живой вирус-вакцины ЛК-ВНИИВВиМ можно создавать специфическую защиту от заболевания и гибели 100% вакцинированных свиней уже через 48 ч после 1-кратного внутримышечного введения ее в дозе 6,0 lgИмД50/гол. Вакцина может быть с успехом использована для обрыва инфекции в неблагополучных хозяйствах и до минимума сократить экономический ущерб. Вакцина из шт. К ранее репродуцировалась в организме кроликов, в настоящее время её размножают в культуре клеток почки эмбриона свиньи. Во ВНИИВВиМ разработан и испытан с положительным эффектом способ пероральной вакцинации новорожденных поросят против КЧС. Единственным и обязательным условием является вакцинация тот час после рождения до контакта с инфицированной средой и до 1-го приема молозива.Поросят допускают к соскам матки не ранее, чем через 30 мин после вакцинация последнего поросенка. В силу строения плаценты ни один класс AT, циркулирующихв организме свиноматки, не передается плоду. Поросята рождаются от иммуннойсвиноматки абсолютно интактными, практически стерильными и имму-нологическикомпетентными. Вакцинировать подсосных поросят, уже получивших молозивоиммунных свиноматок, бессмысленно, так как при наличии колостральных ATпоствакцинальный иммунитет у поросят не формируется. Вынужденная вакцинацияпоросят отъемного возраста чревата риском провокации инфекции, так какнейтрализуя остатки материнских AT, вакцина лишает поросят возможностизащищаться в инфицированной среде. Следовательно, вакцинировать поросят доотъема еще рано, а после отъема уже поздно. Поэтому чрезвычайно важно поросенкавакцинировать перорально до сосания, т.е. практически тотчас после рождения идо контакта его с инфицированной средой, упреждая таким образом внедрениепатогенного вируса.
При пероральном введении вакцинный вирус проникает ворганизм через естественные ворота инфекции, где организм биологическиподготовлен к встрече с агентом, благодаря мощным лимфоидным образованиямглоточного кольца, которые сразу же запускают иммунный процесс. Кроме того, вакцинныйвирус, блокируя чувствительные рецепторы, подчиняя метаболизм клетки и ееэнергетический потенциал регулирующему влиянию генома вакцинного вируса, лишаетполевой вирус обязательных условий, необходимых для проникновения ирепродукции. Срабатывает механизм упреждения. Таким образом, ни последующееинфицирование поросят полевым вирусом, ни массированное поступление с молозивомAT не способны прервать или повлиять на формирование полноценного (ссекреторным компонентом) иммунитета против КЧС. Установленно, что 1-кратнойпероральной вакцинации новорожденных поросят живой вирус-вакциной (ЛК-ВНИИВВиМ)достаточно, чтобы защитить их от заболевания в течение всего технологическогоцикла выращивания вплоть до сдачи на мясокомбинат.
Применение инактивированных вакцин. В прошлые годыпрофилактика КЧС основывалась на применении кристаллвиолетвакцины, которая, несмотря на ряд недостатков, в свое время играла положительную роль в санациихозяйств от данной инфекции. С 1967 г. этот препарат в хозяйствах Российской Федерации истран СНГ не применяется, хотя мысли о возможности получения инактивированногои абсолютно безвредного препарата продолжают поддерживаться. Так, например,Р.Д.Устаров и В.И.Жестерев и соавт. показали, что ВКЧС, выращенный любымитехнологическими приемами, надежно инактивировался сернокислой медью (3-5 мМ) при 37°С в течение 98 чс сохранением иммуногеиных свойств. Использование других инактивантов(глутаральдегид, димер этиленимина, тритон Х-100) не обеспечивало полученияиммуногенных препаратов в нативном виде (максимальная доза АГ). Авторомразработана инактивированная вакцина против КЧС, содержащая культуральныйматериал вирулентного шт. Ши-Мынь, сернокислую медь в качестве инактиванта игидроокись алюминия. Вакцина создавала 100%-ную защиту привитых животных отконтрольного заражения вирулентным вирусом (1000-10000 ЛДдо), в то время каканалогичные препараты из шт. ЛК обеспечивали, в общей сложности, 30%-нуюзащиту. Во Франции разработана инактивированная вакцина против КЧС. Культуральныйвирус инактивировали глутаральдегидом (0,01-0,001%-иым при 25-35°С в течение4-7 ч), а затем эмульгировали в масляном адъюванте. Во ВНИТИБП были полученыопытные образцы инактивированной вакцины против КЧС из шт. Гудзон, выращенногов культурах клеток РК-15, ПЭКр и первичной культуре клеток почки поросенка.Вирус инактивировали этиленимином и эмульгировали с разными маслянымиадъювантами. Вакцина обеспечивала 75-100%-ную защиту в экспериментальныхусловиях при контрольном заражении /10000 ЛД5о . Имеется патент на вакцину,содержащую полипептид вируса КЧС.
О генноинженерной вакцине против КЧС. В 1991 г. было осуществлено встраивание генов гликопротеинов ВКЧС в вектор (вирус осповакцины). Полученный Рекомбинантный вирус оказался высокоиммуногенным. На поверхности клеток зараженных ВКЧС обнаружены гликопротеины ЕО и Е2. Устойчивыми к контрольному заражению оказались только те животные, которые были привиты рекомбинантным вирусом вакцины, экспрессирующим ЕО и(или) Е2 . В настоящее время получен рекомбинатный аттенуированный вирус БА, экспрессирующий gp55 (E2) вируса КЧС.Он вызывал у свиней выраженный иммунитет против обоих вирусов. Иммунизация Свиней белками ЕО и Е2, полученными в оспенно-бакуловирусных системах, также защищала свиней от летальной инфекции вирусом КЧС.
Серологическая оценка поствакцинального иммунитета. Показана Возможность оценки поствакцинального иммунитета по тем же тестам. Например, при помощи РДСК обнаруживали AT в 45% случаев в сыворотке свиней, иммунизированных вакциной АСВ (на 6-7-й день после вакцинации). При иммунизации живыми вакцинами ВНА в крови появляются на 7-10-й день, достигая пика (1:128 и выше) к концу месяца, и сохраняются на высоком уровне в течение всего период невосприимчивости. Вакцинацию можно считать успешной, если титр AT в РН флюоресцирующих микробляшек, спустя 2-5 мес.. после иммунизации, составляет 1:20 и выше. Серологическое обследование поголовья свиней, вакцинированных против КЧС, позволяет оценивать эффективность проведенной вакцинации. Оценка Напряженности поствакцинального иммунитета проводится по титру AT. Так титр AT1:32 и выше свидетельствует о напряженном иммунитете. У молодняка до 2-3-месяцев иммунитет не напряженный и титр AT в РНГА составлял 1:4-1:8. Через 20 дн. после вакцинации поросят вирус-вакциной титр ВНА постепенно повышался до максимального уровня к 60-му дню, клеточной реакции не отмечено. В 3-х группа поросят, привитых штаммами, вызывающими хроническую чуму, ВНА не обнаружено,клеточный иммунный ответ наблюдали у 4 животных из 9. Наивысший клеточный иммунный ответ был у поросят, иммунизированных инактивированным вирусом. После Контрольного заражения вирулентным вирусом выжили все животные.
У поросят, отнятых в 7-дневном возрасте от иммунных животных, пассивная защита может продолжаться свыше 2 месяцев. При этом уровень иммунитета будет зависеть от времени, прошедшего между вакцинацией свиноматки и родами. Так, поросята, рожденные от свиноматок, вакцинированных за 10 месяцев до родов, могут быть вакцинированы не ранее возраста 5 недель.Бустер-вакцинация поросят этой группы в возрасте 6 месяцев вызывала подъем титров AT и устойчивость к вирусу продолжительностью до 4 лет. В ряде опытов поросят, рожденных отсвиноматок, вакцинированных за 1 месяц до случки, иммунизировали в возрасте 5,7 и 9 недель. Несмотря на то, что перед вакцинацией животные имели эквивалентные титры пассивно приобретенных AT, в последующем уровень иммунитета зависел от времени вакцинации: чем позже вакцинированы поросята, тем выше титры AT. Наилучшие результаты получены в группе поросят, вакцинированных в возрасте 9 нед.
Установлено, что при титре ВНА в РН флюоресцирующих бляшек 1:4 и выше животные устойчивы к внутримышечному заражению эпизоотическим штаммом в дозе 104 ЛДзо, при титре 1:2 - переболевают и независимо от исход представляют опасность как вирусоносители. Однако у значительного числа вакцинированных животных ВНА к ВКЧС отсутствуют. Среди поросят 30-дн возрастаAT в титре 1:16 были обнаружены лишь у 30%, у остальных их выявить не удалось.В группах доращивания серопозитивных животных было 16%, в группах откорма через 140-200 да после вакцинации серопозитивные животные составляли 50%. Вакцинация Поросят от не вакцинированных свиноматок в возрасте 9-90 дн. вызывала у них иммунный ответ, который характеризовался появлением в сыворотке крови ВНА, а также защитой от прямого заражения вирулентным шт. ВКЧС в полевых условиях на 12-18-й день после заражения. Высокий уровень AT в сыворотке был обнаружен у поросят через 30-40 да после вакцинации. Отмечено, что материнские AT не ингибируют вакцинный вирус, благодаря чему у них и формируется достаточно напряженный вакцинальный иммунитет. Все контрольные поросята после прямого отражения пали от чумы. Следовательно, материнские AT не обеспечивают достаточно надежную защиту против вирулентных штаммов ВКЧС. Продолжительностьпоствакцинального иммунитета у поросят от не привитых против чумы свиноматок продолжительнее, чем у поросят от вакцинированных свиноматок. В связи с этим поросят от вакцинированных свиноматок предпочтительнее вакцинировать в конце 1-го мес. опороса, однако при неблагополучных эпизоотических ситуациях поросят можно вакцинировать после 2-недельного возраста и через месяц ревакцинировать. Вакцинация поросят, обладающих колостральным пассивным иммунитетом, вызвала появление у них различного иммунного состояния, которое зависело от количество колостральных AT на момент вакцинации. Обнаружено, что иммунизация поросята аттенуированный шт. Тиверваль эффективна тогда, когда нейтрализующая активность сыворотки ниже уровня колостральной нейтрализующей активности. Это так называемый порог эффективности вакцинации, который наступает у поросят в возрасте 30-35 дней. Авторы считают, что вакцинация поросят от иммунных свиноматок в возрасте 30-35 дней надежно защищает их от заражения вирулентным ВКЧС. Период полураспада материнских AT у поросят от свиноматок,иммунизированных за 9 и 5 месяцев или за 85 дней до опороса, составлял 10 дней;AT у поросят обладали высокой или средней авидностью к АГ вируса и оказывали умеренный эффект на иммунный ответ у поросят после активной иммунизации. У поросят от свиноматок, иммунизированных за 55 дней до опороса, период полураспада молозивных AT составлял 6 да; AT обладали слабой активностью и взначительной мере подавляли образование AT после активной иммунизации у поросят. У поросят от свиноматок, вакцинированных до супоросности, пассивный иммунитет сохранялся до 2 месяцев, а у поросят от свиноматок, вакцинированных за 10 месяцев до беременности, пассивный иммунитет сохранялся до 5 месяцев. Вакцинация в этот срок защищала более 80% поросят. Если поросят вакцинировали в возрасте 9 недель, то прочный иммунитет у них поддерживался в течение 4 лет.
В последние годы КЧС в хозяйствах, где проводится ежегодная плановая профилактическая иммунизация животных, часто проявляется по типу персистирующей инфекции, что значительно затрудняет постановку диагноза, оценку эпизоотического статуса свинопоголовья и своевременность проведения противоэпизоотических мероприятий.
Для контроля эффективности профилактической иммунизации против КЧС И.Ф. Вишняков и соавторы рекомендовали проведение серологического обследования свинопоголовья в РНФБ с использованием культуры клеток РК-15.
К серотерапии классической чумы свиней. При лечении поросят гипериммунными сыворотками получали разный исход в зависимости от стадии болезни в момент серотерапии. Так, лечение свиней через 8 сут. после заражения не защищает их от гибели, а лечение в более ранние сроки приводит к переводуострого течения в хроническое и позволяет животным выживать в течение месяца после гибели контрольных животных. Однако у таких свиней выявляется постоянная виремия - титр вируса в лейкоцитах достигал 104 ККИД 50/млн. кл., а введение иммуномодуляторов больным животным приводило к быстрому летальному исходу в течение 1-2 сут. Все ингибиторы воспалительной реакции вполне способны ликвидировать симптомы болезни, но не ликвидировать персистенцию вируса в клетках-мишенях - макрофагах. В то же время все активаторы воспалительной реакции (ЛПС, адъюванты, некоторые медиаторы и т.п.) усиливают симптомы болезни и ускоряют гибель свиней от КЧС (сверх острое течение). Получены высокоактивные моноспецифические сыворотки крови с титрами ВНА 1:16-1:64 и более.
Химиотерапия КЧС. Во ВНИИВВиМ впервые установили эффективность нетрадиционной химиотерапии. Применение больным животным комплекса препаратов,обладающих противо-воспалительным и антибактериальным действием (фарма комплекс Анти-КЧС) не позднее 7 сут. после заражения вирулентным ВКЧС в дозе 20000 ЛД50 животное приводило в 100% случаев к клиническому выздоровлению подсвинков в течение 2-4 суток после начала лечения. После выживания поросят в критический период(7-11 суток после инфекции) уровень постинфекционных ВНА у них достигал на 14-е сутки защитного титра (4 log2 ) и обеспечивал напряженный и продолжительный иммунитет. Однако следует иметь в виду, что переболевшие подсвинки представляют определенную опасность как потенциальные вирусоносители и должны выбраковываются. Стоимость полного курса терапии летально инфицированных свиней указывает на вполне реальную экономическую целесообразность данного мероприятия в индивидуальном порядке.
Предложена новая концепция патогенеза КЧС, на основе которой разработаны способы обострения хронической болезни и основы патогенетической терапии летально инфицированных животных. Установлено, что использование активаторов воспалительной реакции позволяет переводит хроничекое течение болезни в острое, что может иметь диагностическое значение при КЧС. Разработан эффективный фармакомплекс "Анти-КЧС", позволяющий добиваться лечебного эффекта в 100% случаев при применении не позднее, чем за 4 сут. до гибели животных.
Ветеринарно–санитарная экспертиза. Туши и продукты убоя от больных и подозрительных по заболеванию выпускать в сыром виде запрещается. При наличие дегенеративных или других патологических изменений в мускулатуре тушу с внутренними органами направляют на утилизацию. При отсутствии патологических изменение направляют образцы на бактериологическое исследование на сальмонеллёз. В случае обнаружения сальмонелл внутренние органы утилизируют, а тушу направляют на проварку. При отсутствие сальмонелл разрешается перерабатывать на варёные, варёно –копчёные колбасы , консервы или проварку.
